Zastosowanie PCR w diagnostyce chorób zakaźnych u psów i kotów

PCR w diagnostyce weterynaryjnej jest metodą molekularną pozwalającą wykrywać materiał genetyczny określonych patogenów w próbkach pobranych od zwierzęcia. Znajduje zastosowanie w rozpoznawaniu wielu zakażeń u psów i kotów, w tym wybranych infekcji wirusowych, bakteryjnych i pasożytniczych. Należy jednak pamiętać, że wartość diagnostyczna badania zależy m.in. od rodzaju testu, badanego patogenu, doboru próbki oraz momentu jej pobrania.

Czym jest badanie PCR w diagnostyce weterynaryjnej?

Badanie PCR u zwierząt służy do wykrywania określonych fragmentów materiału genetycznego drobnoustrojów w materiale biologicznym. Metoda opiera się na amplifikacji, czyli wielokrotnym powielaniu wybranego fragmentu kwasu nukleinowego, dzięki czemu możliwe staje się jego wykrycie. Test jest ukierunkowany na konkretny patogen lub grupę patogenów, dlatego lekarz dobiera go na podstawie obrazu klinicznego i podejrzeń diagnostycznych.

Klasyczna metoda PCR służy do amplifikacji DNA. W przypadku patogenów, których materiałem genetycznym jest RNA, stosuje się etap odwrotnej transkrypcji, podczas którego RNA jest przepisywane na DNA – stąd określenie RT-PCR. Diagnostyka molekularna w weterynarii uzupełnia metody stosowane w laboratoriach i gabinetach, umożliwiając bezpośrednie poszukiwanie materiału genetycznego określonego czynnika zakaźnego.

Kiedy stosuje się PCR u psów i kotów?

Test PCR dla psa i kota może być stosowany przede wszystkim wtedy, gdy objawy, wywiad lub inne wyniki badań wskazują na możliwość zakażenia określonym patogenem. Badanie może pomóc w potwierdzeniu podejrzenia choroby zakaźnej, a w odpowiednio dobranych przypadkach stanowi element diagnostyki różnicowej. Jego zastosowanie zależy jednak od konkretnej choroby – nie istnieje jeden uniwersalny test PCR wykrywający wszystkie możliwe zakażenia.

Metody molekularne wykorzystuje się także przy niespecyficznych objawach, gdy lekarz bierze pod uwagę kilka potencjalnych przyczyn. Mogą być przydatne również w kontroli zakażeń w większych populacjach zwierząt, np. w hodowlach czy schroniskach, jeśli dla danego patogenu istnieją odpowiednie wskazania do takiego badania. Diagnostyka chorób zakaźnych u zwierząt powinna uwzględniać ponadto wywiad, badanie kliniczne i inne testy laboratoryjne.

Jakie choroby zakaźne można diagnozować metodą PCR?

PCR znajduje zastosowanie w diagnostyce wybranych zakażeń wirusowych, bakteryjnych oraz pasożytniczych psów i kotów. Zakres dostępnych badań zależy od laboratorium, a wybór konkretnego testu powinien wynikać z podejrzewanej choroby. Istotne jest także pobranie materiału, w którym na danym etapie zakażenia istnieje największa szansa wykrycia materiału genetycznego patogenu.

Choroby wirusowe u psów i kotów

W przypadku zakażeń wirusowych PCR lub RT-PCR może być wykorzystywany m.in. w diagnostyce nosówki u psów, zakażeń parwowirusowych oraz wybranych infekcji wirusowych kotów. Przykładowo RT-PCR jest jedną z metod stosowanych przy potwierdzaniu zakażenia wirusem nosówki. Rodzaj próbki może obejmować m.in. krew, wymazy, kał, mocz, płyny ustrojowe lub tkanki – zależnie od właściwości konkretnego wirusa i przebiegu zakażenia.

Choroby bakteryjne

Metody PCR umożliwiają również wykrywanie DNA określonych bakterii. Mogą być stosowane m.in. w diagnostyce zakażeń wywoływanych przez Leptospira spp., Chlamydia felis czy bakterie z rodzaju Ehrlichia i Anaplasma. W przypadku niektórych zakażeń molekularne wykrywanie patogenu łączy się z serologią lub innymi badaniami. Przykładem jest leptospiroza u psów, przy której znaczenie ma zarówno rodzaj materiału, jak i faza zakażenia – na różnych etapach wykorzystuje się m.in. krew lub mocz.

Choroby pasożytnicze i odkleszczowe

PCR wykorzystuje się także w diagnostyce niektórych zakażeń przenoszonych przez wektory oraz chorób wywoływanych przez pierwotniaki. Przykładem jest wykrywanie DNA Babesia spp. we krwi. W przypadku chorób wektorowych wybór materiału ma szczególne znaczenie, ponieważ liczba patogenów obecnych w krążeniu może zmieniać się wraz z przebiegiem infekcji. Ujemny wynik nie zawsze wystarcza więc do wykluczenia zakażenia.

Jak przebiega badanie PCR u zwierzęcia?

Badanie PCR obejmuje pobranie odpowiedniej próbki, przygotowanie materiału genetycznego, amplifikację wybranego fragmentu DNA oraz analizę uzyskanego wyniku. W przypadku patogenów RNA konieczny jest dodatkowo etap odwrotnej transkrypcji. Z perspektywy opiekuna zwierzęcia najważniejsze znaczenie ma zazwyczaj prawidłowe pobranie próbki.

Pobranie próbki

Materiał pobiera się w zależności od rodzaju podejrzewanego zakażenia. Może to być np. krew, wymaz, mocz, kał, płyn ustrojowy albo fragment tkanki. Ważne są właściwa technika pobrania, odpowiednie zabezpieczenie materiału i jego transport.

Izolacja materiału genetycznego

W laboratorium z próbki izoluje się kwasy nukleinowe, czyli DNA lub RNA. Materiał musi zostać odpowiednio przygotowany, aby możliwe było przeprowadzenie kolejnych etapów analizy. Jakość próbki ma znaczenie, ponieważ obecność substancji hamujących reakcję PCR lub degradacja kwasów nukleinowych może utrudnić wykrycie patogenu.

Amplifikacja DNA lub RNA

Kolejnym etapem jest powielanie wybranego fragmentu materiału genetycznego. Test wykorzystuje startery zaprojektowane w taki sposób, aby rozpoznawały określone sekwencje charakterystyczne dla poszukiwanego patogenu. Przy diagnostyce patogenów RNA materiał jest najpierw przekształcany w komplementarne DNA, które może następnie zostać poddane amplifikacji.

Analiza i interpretacja wyniku

Po zakończeniu reakcji ocenia się, czy w próbce wykryto poszukiwaną sekwencję. Wynik nie powinien być jednak rozpatrywany w oderwaniu od stanu pacjenta. Lekarz bierze pod uwagę objawy, wywiad, wcześniejsze leczenie, rodzaj próbki i wyniki pozostałych badań. Dzięki temu PCR w diagnostyce weterynaryjnej staje się częścią szerszego procesu rozpoznawania choroby.

Jakie próbki wykorzystuje się do badań PCR u zwierząt?

Rodzaj próbki do PCR dobiera się do podejrzewanej choroby, lokalizacji patogenu i etapu zakażenia. Ten sam materiał nie będzie odpowiedni do diagnostyki wszystkich infekcji. Przykładowo przy jednej chorobie najlepszym materiałem może być krew, a przy innej wymaz z błon śluzowych, kał, mocz lub materiał tkankowy.

W zależności od wskazań do badania PCR u zwierząt wykorzystuje się m.in.:

• krew pełną, osocze lub surowicę, jeśli są właściwe dla danego testu,
• wymazy m.in. z nosa, gardła, spojówek lub innych błon śluzowych,
• kał,
• mocz,
• materiał tkankowy,
• płyny ustrojowe, np. płyn z jam ciała lub płyn mózgowo-rdzeniowy.

O wyborze materiału decydują zalecenia dotyczące konkretnego testu oraz właściwości biologiczne patogenu. Znaczenie ma również sposób zabezpieczenia i transportowania próbki. W niektórych zakażeniach patogen może być obecny w określonym materiale tylko w części przebiegu choroby, dlatego niewłaściwy wybór próbki zwiększa ryzyko uzyskania wyniku fałszywie ujemnego.

Jak interpretować wynik PCR?

Dodatni wynik PCR oznacza, że w badanej próbce wykryto materiał genetyczny, na który ukierunkowany był test. Nie zawsze jest to jednak równoznaczne z występowaniem aktywnej choroby klinicznej. W określonych sytuacjach DNA lub RNA może zostać wykryte również u zwierzęcia bez objawów albo materiał genetyczny może utrzymywać się po ustąpieniu aktywnego zakażenia.

Ujemny wynik oznacza natomiast, że w konkretnej próbce nie wykryto poszukiwanego materiału genetycznego na poziomie umożliwiającym jego identyfikację przez zastosowaną metodę. Nie zawsze całkowicie wyklucza to infekcję. Wynik fałszywie ujemny może wiązać się m.in. ze zbyt małą ilością patogenu w próbce, nieodpowiednim momentem pobrania, wcześniejszym leczeniem, niewłaściwym materiałem czy problemami dotyczącymi jakości próbki.

Z tego powodu diagnostyka laboratoryjna zwierząt nie powinna opierać się na pojedynczym wyniku bez odniesienia do obrazu klinicznego. Znaczenie mają czułość i swoistość konkretnego testu, prawdopodobieństwo zakażenia przed wykonaniem badania oraz informacje dotyczące pacjenta. Wynik PCR interpretuje lekarz weterynarii razem z objawami, wywiadem i wynikami pozostałych badań.

PCR a inne metody diagnostyczne w weterynarii

PCR odpowiada na inne pytanie diagnostyczne niż hematologia, biochemia czy badanie moczu. Test molekularny poszukuje materiału genetycznego określonego patogenu, podczas gdy pozostałe badania mogą dostarczać informacji o stanie organizmu i funkcjonowaniu narządów. Z tego względu metody te częściej się uzupełniają, niż wzajemnie zastępują.

W wyposażeniu laboratorium lub lecznicy istotną funkcję pełni analizator hematologiczny, który pozwala oceniać parametry morfologiczne krwi. Uzupełnieniem zaplecza jest analizator biochemiczny weterynaryjny, umożliwiający oznaczanie parametrów pomocnych w ocenie funkcjonowania narządów. W zależności od profilu placówki, przydatny może być również analizator moczu weterynaryjny.

Szeroko rozumiana diagnostyka kliniczna zwierząt wymaga bowiem łączenia danych pochodzących z różnych źródeł. Odpowiednio dobrane analizatory weterynaryjne wspierają wykonywanie badań bezpośrednio w placówce, podczas gdy część specjalistycznych oznaczeń molekularnych może być realizowana przez laboratoria referencyjne. Rozwiązania wykorzystywane w diagnostyce klinicznej zwierząt pozwalają rozbudować zaplecze potrzebne do kompleksowej oceny pacjenta.

Jakie są zalety diagnostyki PCR w weterynarii?

Jedną z najważniejszych zalet PCR jest możliwość ukierunkowanego wykrywania materiału genetycznego konkretnego patogenu. Przy właściwie zaprojektowanym i dobranym teście metoda może charakteryzować się wysoką swoistością analityczną. Pozwala też identyfikować patogen bez konieczności oczekiwania na wytworzenie przez organizm zwierzęcia przeciwciał, co w określonych zakażeniach może mieć znaczenie na wcześniejszych etapach diagnostyki.

Atutem jest również możliwość badania różnych rodzajów materiału biologicznego, o ile są one odpowiednie dla konkretnego patogenu. PCR może wspierać diagnostykę różnicową, gdy podobne objawy występują w przebiegu kilku chorób. Zastosowanie paneli obejmujących więcej niż jeden cel molekularny może dodatkowo ułatwiać poszukiwanie potencjalnej przyczyny objawów, jeśli jest uzasadnione klinicznie.

Jakie są ograniczenia badania PCR?

PCR nie jest badaniem, którego dodatni lub ujemny wynik można zawsze interpretować jako jednoznaczne potwierdzenie albo wykluczenie choroby. Metoda wykrywa określony materiał genetyczny, a nie sam fakt występowania objawowej, aktywnej infekcji. W niektórych sytuacjach możliwe jest wykrycie kwasu nukleinowego drobnoustroju również wtedy, gdy jego obecność nie odpowiada za aktualne objawy pacjenta.

Na wiarygodność wyniku wpływają także jakość próbki, miejsce i moment jej pobrania, ilość materiału genetycznego oraz właściwości konkretnego testu. Zbyt mała ilość patogenu może prowadzić do wyniku ujemnego pomimo zakażenia. W przypadku niektórych infekcji wcześniejsze zastosowanie leczenia również może zmniejszyć prawdopodobieństwo wykrycia drobnoustroju. Dlatego wynik powinien być zawsze interpretowany przez lekarza weterynarii w kontekście konkretnego przypadku.

PCR a kompleksowa diagnostyka chorób zakaźnych zwierząt

PCR jest jednym z elementów diagnostyki chorób zakaźnych i nie stanowi uniwersalnego zamiennika badania klinicznego, morfologii, biochemii czy innych testów laboratoryjnych. Lekarz najpierw ocenia pacjenta i określa najbardziej prawdopodobne rozpoznania, a następnie dobiera badania, które mogą dostarczyć informacji potrzebnych do ich potwierdzenia lub wykluczenia.

Przykładowo PCR może wskazać obecność materiału genetycznego konkretnego patogenu, natomiast morfologia pomaga ocenić zmiany dotyczące komórek krwi, a biochemia dostarcza informacji o wybranych funkcjach narządów. Takie połączenie pozwala spojrzeć zarówno na możliwą przyczynę zakaźną, jak i reakcję organizmu pacjenta. Dlatego dobrze zaplanowana diagnostyka chorób zakaźnych u zwierząt wykorzystuje metody dostosowane do objawów, wywiadu i podejrzewanej jednostki chorobowej.

Najczęściej zadawane pytania

Co wykrywa badanie PCR u psa lub kota?

PCR wykrywa określone fragmenty materiału genetycznego – DNA lub, po zastosowaniu odpowiedniej procedury, RNA – poszukiwanego patogenu. Test musi być ukierunkowany na konkretny drobnoustrój albo określoną grupę drobnoustrojów.

Z jakiego materiału wykonuje się PCR u zwierząt?

Materiał zależy od podejrzewanego zakażenia i może obejmować m.in. krew, wymaz, kał, mocz, płyny ustrojowe lub tkanki. Dobór właściwej próbki wpływa na wartość diagnostyczną badania.

Czy dodatni PCR oznacza chorobę?

Nie zawsze. Dodatni wynik potwierdza wykrycie docelowego materiału genetycznego w próbce, ale jego znaczenie kliniczne zależy od patogenu, rodzaju próbki, objawów i sytuacji pacjenta.

Czy ujemny wynik PCR wyklucza zakażenie?

Nie w każdym przypadku. Wynik ujemny może wystąpić m.in. wtedy, gdy w próbce znajduje się zbyt mało materiału genetycznego, została ona pobrana w nieodpowiednim momencie lub wybrano materiał niedostosowany do biologii danego zakażenia.

Ile czasu wykonuje się badanie PCR u zwierząt?

Czas oczekiwania nie jest jednakowy dla wszystkich badań. Zależy m.in. od rodzaju testu, organizacji pracy danego laboratorium, sposobu transportu próbki oraz tego, czy oznaczenie wykonywane jest na miejscu, czy materiał jest wysyłany do laboratorium zewnętrznego.

Czym PCR różni się od badania krwi?

PCR poszukuje materiału genetycznego określonego patogenu w odpowiednio dobranej próbce. Morfologia krwi ocenia natomiast m.in. erytrocyty, leukocyty i płytki krwi, a badania biochemiczne określone parametry związane m.in. z funkcjonowaniem narządów. Są to więc badania dostarczające różnych informacji.

Kiedy lekarz weterynarii może zlecić badanie PCR?

Lekarz może rozważyć PCR m.in. przy podejrzeniu określonej choroby zakaźnej, potrzebie potwierdzenia obecności patogenu lub w ramach diagnostyki różnicowej. Decyzja zależy od objawów, wywiadu, sytuacji epidemiologicznej oraz dostępności odpowiedniego testu.